摘要：取新生大鼠大脑皮层进行体外神经细胞培养，用谷氨酸建立离体的神经元损害模型，观察天麻素对兴奋性氨基酸神经毒性的影响。结果表明：200μmol/L谷氨酸作用10min能造成培养神经元的大量死亡，培养液中乳 酸脱氢酶(LDH)含量明显增高；在培养液中加入天麻素或氯胺酮可明显降低神经细胞死亡率，减少乳酸脱氢酶的漏出。提示天麻素可拮抗兴奋性氨基酸神经毒性。

　　Protective Effects of Gastrodine on Injured Cortical Neurons by Glutamic Acid 

　　Xue Liuhua(薛柳华),Tang Yipeng(唐一鹏),Hong Qingtao(洪庆涛),et al.

　　(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)

　　ABSTRACT：Cerebral cortex of the newborn rat was used for neurons cu lture in vitro. An isolated pattern of injured neuro by glutamic acid was built up. Observe the effect of gastrodine on the neurotoxicity of excitatory amino ac id. The results show that: Glutamic acid can cause the expiration of cultured ne urons in large quantities and the amount of lactic dehydrogenase (LDH) in the nu trient solution can be markedly increased. By adding gastrodine or ketamine into th e nutrient solution, mortality rate of the neurons can be significantly decrease d and the transudation of LDH also diminished, which suggests gastrodine ca n antagonize the neurotoxicity of excitatory amino acid.

　　KEY WORDS：Gastrodine; Glutamic Acid; Cultured neuron; Rat

　　谷氨酸是脑内兴奋性突触的主要神经递质之一，已证实在脑损伤等病理情况下，谷氨酸参与了神经细胞的损害。本研究观察了天麻素对谷氨酸所致兴奋性神经毒性的影响，以期为临床用药提供实验依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　实验动物

　　新生当天Wistar大鼠，由北京医科大学动物中心提供。

　　1.2　大脑皮层神经元原代培养

　　根据文献［1］方法进行，在解剖镜下取新生24h内Wistar大鼠大脑皮层，用0.125%胰蛋白酶消化30min(37℃)。制备成1.0×109L-1密度的细胞悬液。按每皿中2mL的细胞悬液接种于已涂有胶原的35mm培养皿中。随后置于含94%空气、6%CO2的37℃培养箱内培养8d。培养液为DMEM。培养第3～5天加入10-5mol/L阿糖胞苷以抑制非神经细胞增殖。

　　1.3　谷氨酸对体外培养神经细胞兴奋毒性模型的建立

　　参考文献［2，3］方法，将体外培养8d的神经细胞培养液中加入200μmol/L谷氨酸钠作用10min，用解剖液(NaCl8g,KCl0.4g，Na2HPO4．7H2O0.18g,KH2PO40.03g,蔗糖3g，葡萄糖7.5g，Hepes2.34g，加蒸馏水至1000mL)漂洗1次。换无血清培养液继续培养24h；正常对照组加入20μL培养液，用解剖液漂洗1次，换无血清培养液继续培养24h；阳性对照药组用氯胺酮50μmol/L，天麻素设3个剂量组：52mg/L、26mg/L、13mg/L各组用药20min后加入谷氨酸钠200μmol/L，作用10min后用解剖液漂洗1次，换无血清培养液，并继续加药，培养24h。

　　1.4　培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的测定

　　取上述经处理继续培养24h后的无血清培养液，每皿0.3mL，3000r/min离心10min，按文献［4］方法测定LDH，结果按每皿中蛋白量进行计算，按Bradford法测定细胞蛋白量［5］。

　　1.5　细胞染色计数

　　上述经药物处理继续培养24h的细胞，用解剖液清洗1次，取0.9%NaCl配制的0.4%台盼蓝溶液200μL直接滴于盖玻片上，3min后镜检。每一盖片中心处随机计数500个细胞中着蓝染(为死亡细胞)及不着蓝染(为存活细胞)的细胞个数计算细胞死亡率。

　　1.6　药品

　　天麻素由北京中医药大学中药学院魏璐雪教授提供；谷氨酸钠为北京化工厂分析纯产品；氯胺酮为北京制药厂产品。

　　2　结果

　　2.1　天麻素对谷氨酸所致神经细胞LDH漏出的影响

　　200μmol/L谷氨酸钠作用于神经细胞10min，培养液中LDH浓度明显增加，经天麻素或氯胺酮作用的细胞LDH漏出量明显降低，差异非常显著(P＜0.01)，见表1。

　　2.2　天麻素对谷氨酸所致神经细胞死亡率的影响

　　神经细胞暴露于200μmol/L谷氨酸10min，即可造成神经细胞的大量死亡，加用天麻素或氯胺酮后神经细胞死亡率明显下降，差异非常显著(P＜0.01)。见表1。

　　表1　天麻素对谷氨酸所致神经细胞LDH漏出及细胞死亡率的影响(±s)

　　组别 剂量 LDH/mu/mgpro 细胞死亡率/% 

　　正常组 —

　　　2.79±1.06***

　　　7.4±0.9***

　　损伤组 200μmol/L

　　11.65±2.03 57.8±3.6 

　　天麻素组 52mg/L 7.73±2.03* 36.4±2.9*** 

　　天麻素组 26mg/L 8.33±2.06* 40.4±4.2** 

　　天麻素组 13mg/L 8.64±1.90* 46.0±5.1** 

　　氯胺酮组 50μmol/L 5.69±1.11*** 33.2±4.3*** 

　　注：与损伤组比较：*P＜0.05　**P＜0.01　***P＜0.001