1　材料和方法

　　1.1　植物材料

　　新鲜黄天麻(Gastrodia elata Bl. f. flavida S. Chow)次生球茎购自中国医学科学院药用植物研究所。

　　1.2　植物总RNA的提取和mRNA的纯化

　　取新鲜天麻次生球茎皮层部分在液氮中研磨成粉末， 总RNA提取主要依据Chomczynski和Sacchi［9］的方法。mRNA的纯化使用Dynabeads mRNA Purification Kit(DYNAL, A.S, Norway)。

　　1.3　双链cDNA的合成和Adaptor的连接

　　将纯化的mRNA反转录合成cDNA(Marathon cDNA Amplification Kit, Clontech)。Adaptor 与双链 cDNA 的连接依据Marathon cDNA Amplification Kit 的实验程序完成。

　　1.4　应用RACE的方法，以与Adaptor连接的双链cDNA为模板，扩增GAFP-1全长cDNA

　　1.4.1　3′ RACE扩增　依据GAFP-1 N端氨基酸序列设计简并引物(图1)，扩增含3′末端的cDNA片段(3′RACE扩增产物)。引物序列如下，P1(正向简并引物)：5′-TCCGAYCGTYTGAACTCNGGNCAYCAR-3′(Y=C/T, N=A/G/C/T, R=A/G)。 P1′(正向简并嵌套引物)：5′-CTCGCCCAGGGYGGCTAYCTRTTYATC-3′(Y=C/T，R=A/G)。

　　图1　引物设计

　　Fig.1　Primer design

　　1.4.2　依据3′RACE扩增产物的核苷酸序列设计特异引物(图1)，扩增包括5′末端的cDNA片段(5′RACE扩增产物)　引物序列如下，P2(反向特异引物)：5′-GTTACCGTTTTGGCGATTGGTGTTGCT-3′。P2′(反向嵌套特异引物)：5′-TGCCCATATTGCCCTGCTA-CCGCTATA-3′。

　　1.4.3　依据5′RACE 和3′RACE扩增产物的核苷酸序列设计特异引物(图1)，扩增GAFP-1全长cDNA　引物序列如下，P3(正向特异引物)：5′-GGTATTCCACCTAGCCATCAAGCAGCC-3′。P3′(正向嵌套特异引物)：5′-ATGGCAGCATCCGCAAGCACTGC-GGTA-3′。P4 (反向特异引物)：5′-TATTCTCTTAGACCGCTAGTACATGGA-3′。

　　1.4.4　Adaptor 引物　Adaptor 引物(AP1) 及 Adaptor 嵌套引物(AP2)由Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech)提供。引物序列如下：AP1：5′-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3′。AP2：5′-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3′。

　　1.4.5　PCR扩增　反应体系为50 μL，包括模板0.5 ng，两种引物各10 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，1×Advantage cDNA polymerase mix 及 1×cDNA PCR 反应缓冲液(Clontech)。 PCR反应在PE Gene Amp System 9600上进行，循环参数: 94 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s， 72 ℃ 3 min， 5个循环；94 ℃ 30 s， 70 ℃ 3 min， 5个循环；94 ℃ 20 s，68 ℃ 3 min， 25个循环。

　　将PCR扩增产物回收克隆到pGEM-T vector( Promega)， 使用ABI PRISM 377 DNA Sequencer(Perkin-Elmer) 进行序列测定。序列分析采用GCG version 7.0 软件(Wisconsin University)， 通过Blast 2.0 network service 与GenBank中已报道的序列进行同源比较。 蛋白质结构域预测使用Protein Prediction 软件(EMBL-Heidelberg)。

　　2　实验结果

　　2.1　3′RACE 扩增

　　依据GAFP-1 N端部分氨基酸序列设计简并引物P1 及其嵌套引物P1′， 以连接Adaptor的双链cDNA为模板， 与Adaptor 引物(AP1、AP2)共同扩增含3′末端的cDNA片段(图2，a)。以P1和AP1为引物进行第一轮PCR，扩增得到600 bp左右的片段。为提高扩增产物的特异性， 以第一轮PCR产物为模板，通过嵌套引物P1′和AP2 进行第二轮的嵌套PCR扩增， 得到了特异性很强的单一条带，分子量在550 bp左右。将此片段回收克隆至pGEM-T vector 进行序列测定， 结果如图3(207～757 bp)所示。 此片段命名为3R1.2。3R1.2全长554 bp，编码一个含128个氨基酸的片段，此氨基酸序列与我们通过蛋白质测序得到的N端部分序列［6］ 以及中间肽段序列完全一致。在终止密码子下游， 3R1.2还包含有一个长141 bp 的 3′非编码区，其中包括两个聚腺苷酸化信号, AATAAA， 以及一个含26个腺苷酸的poly(A)。

　　2.2　5′RACE 扩增

　　依据3R1.2的核苷酸序列设计特异引物P2及其嵌套引物P2′， 与Adaptor 引物(AP1、AP2 )共同扩增含5′末端的cDNA片段(图2，b)。以P2和AP1 为引物的第一轮PCR扩增得到420 bp的片段，通过P2′和AP2进行的嵌套PCR扩增,得到特异性较强的400 bp左右的片段。此片段回收克隆至pGEM-T vector 进行序列测定(图3，1～380 bp)。片段命名为 5R2.2。5R2.2 全长380 bp， 编码一个含101个氨基酸的片段。 此氨基酸序列与我们在蛋白质序列测定中得到的N端部分序列完全一致。5R2.2与3R1.2有一个含174 bp(207～380 bp)的重叠区。根据转译起始位点的预测结果可推断蛋白质的转译是从第55位的ATG开始，这也是读码框的第一个ATG。依据成熟蛋白的N端部分序列， 推测其信号肽剪切位点位于第28位的丙氨酸与第29位的丝氨酸之间，即可能切除一个含28个氨基酸的信号肽。在第55位的ATG上游，5R2.2还包括一个长55 bp的5′非编码区。